1、 標(biāo)本的固定：不當(dāng)?shù)墓潭ǚ绞交蚬潭〞r(shí)溫度過(guò)高，都會(huì)影響到所檢測(cè)的抗原的數(shù)量和質(zhì)量。查看一抗說(shuō)明書(shū)或相關(guān)文獻(xiàn)，使用推薦的固定液（如10%中性緩沖福爾馬林固定液等）。

2、抗原的修復(fù)方式：煮沸修復(fù)和高壓修復(fù)是國(guó)際公認(rèn)的較好的修復(fù)方式，但具體使用那種修復(fù)方式應(yīng)根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果或廠家說(shuō)明書(shū)進(jìn)行選擇。

3、抗體的稀釋度是否過(guò)高或者孵育的溫度/時(shí)間是否正確。應(yīng)參照使用范圍，對(duì)所使用的一抗進(jìn)行梯度測(cè)試，找出最佳的使用濃度。通常，如果背景染色很少或沒(méi)有，可適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間。

4、切片上遺留了過(guò)多的沖洗液，當(dāng)抗體加至切片上時(shí)，等于人為地對(duì)抗體進(jìn)行了進(jìn)一步的稀釋。

5、 孵育時(shí)切片是否放置水平，否則會(huì)導(dǎo)致抗體流失。

1、抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、抗體濃度高易增加背景著色，這可通過(guò)縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來(lái)控制。

2、一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體。

3、內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細(xì)胞多的組織），需要通過(guò)延長(zhǎng)滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來(lái)降低背景染色。

4、非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過(guò)延長(zhǎng)二抗來(lái)源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來(lái)加強(qiáng)封閉效果。

5、DAB孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或濃度過(guò)高，可通過(guò)降低DAB濃度或者縮短孵育時(shí)間來(lái)降低背景染色。

6、PBS沖洗不充分，殘留抗體結(jié)果增強(qiáng)著色，在一抗/二抗/SP孵育后的浸洗尤為重要。

7、標(biāo)本染色過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)干片，這容易增強(qiáng)非特異性著色，確保實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保證切片的濕潤(rùn)。

8、抗體稀釋液的pH值偏低和封閉血清的失效。